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组氨酸标签

在生产重组蛋白的载体中，经常使用指定6至9个组氨酸残基的 DNA 序列。其结果是表达出一种在其N 端或 C 端融合了6xHis 或 poly-His 标记的重组蛋白。由于组氨酸残基串在特定缓冲液条件下会与多种类型的固定化金属离子（包括镍，钴和铜）结合，因此表达的 His标签蛋白很容易纯化和检测。此外，市售的抗 His标签抗体也可用于涉及 His标记蛋白的测定方法。无论在哪种情况下，标签提供了一种无需蛋白特异性抗体或探针即可特异性纯化或检测重组蛋白的方法。

重组蛋白质纯化选择指南

本页内容固定金属亲和层析 (IMAC)镍，钴和铜其他 His 标签融合蛋白技术查看和选择产品重组蛋白质纯化选择指南

固定金属亲和层析 (IMAC)

珠状琼脂糖或磁性颗粒等支持物可通过螯合基团进行衍生，以固定所需的金属离子，然后将其作为配体，用于结合和纯化所需的生物大分子。这种亲和纯化的基础被称为固定金属亲和层析 (IMAC)。IMAC 是一种广泛使用的快速纯化多聚组氨酸亲和标签蛋白的方法，只需一个纯化步骤就能使蛋白质富集100倍。

IMAC最常用的螯合剂配体是次氮基三乙酸 (NTA) 和亚氨基二乙酸 (IDA)。制备好 IDA 琼脂糖或 NTA 琼脂糖树脂后，就可以用所需的二价金属（例如 Ni、Co、Cu 和 Fe）对其进行 "负载"。以镍作为示例，制备出的亲和支持物通常被称为镍螯合物、Ni-IDA 或 Ni-NTA 树脂。支持物的特定金属和螯合化学性质决定了其结合特性以及是否适用 IMAC 的特定应用。

亲和纯化 His 标签融合蛋白是金属螯合物支持物在蛋白质生物学研究中较常见的应用。通过 NTA 螯合化学固定的镍或钴金属是这种应用的首选系统（参见下一节）。此外，不同种类的琼脂糖树脂提供的支持物也非常适合用于小规模（96 孔过滤板）或大规模（FPLC 系统中色谱纯化柱系列）的His 标签蛋白纯化。将镍-NTA Superflow 琼脂糖等树脂填充到合适的色谱柱或色谱管中时，每毫升琼脂糖珠可纯化 1 至 80 毫克的 His 标签蛋白。与用于 IMAC 的钴和其他配体相比，镍能提供更大的组氨酸标记蛋白纯化能力。Thermo Fisher Scientific 提供的 HisPur Ni-NTA Superflow 琼脂糖在一定流速范围内具有较高的动态结合能力，是大规模纯化的绝佳选择。

高产量、高纯度、中等规模纯化 6xHisTagged 蛋白。使用含 HisPur Ni-NTA Superflow 琼脂糖的 200 mL色谱柱在 3 小时内纯化 4 克以上的过表达 6xHis-GFP蛋白。以 20 mL/min 的流速上样一升裂解物，然后用含 30 mM 咪唑的洗涤缓冲液洗涤直至基线。使用含 300 mM 咪唑的缓冲液洗脱结合蛋白。使用 Pierce 660 nm 蛋白测定 (货号 22662）混合并定量测定含有纯化 6xHis-GFP 的组分。通过 SDS-PAGE 分离上样液、流过物、洗涤液和洗脱液组分，然后用 Imperial 蛋白染色剂（货号 24615）染色，并采用 myImageAnalysis 软件（货号 62237）进行评估以测定纯度。

在近中性缓冲液条件(生理 pH 和离子强度) 下，聚 His 标签与IMAC 树脂的结合效果较佳。典型的结合/洗涤缓冲液由含 10-25 mM 咪唑的 Tris 缓冲盐水 (TBS) pH 7.2 组成。低浓度咪唑有助于防止具有组氨酸簇的内源性蛋白的非特异性结合。(事实上，抗体中就有这样富含组氨酸的簇，并且可以使用 IMAC 化学的一种变体进行纯化。)

高浓度盐和某些变性剂（例如 8 M 尿素等离液剂）是兼容的，因此可从各种起始缓冲液中纯化样品。因此，在设计和表达可能需要从包涵体中纯化变性重组蛋白时，最好使用 His标签。(与 GST 标签不同，后者是一种必须保持功能才能进行纯化的酶。)值得注意的是，EDTA 和还原剂（如 DTT 和 TCEP）会剥离金属，从而对普通 Ni-IMAC 支持物的性能产生不利影响。不过，有一种特殊设计的 Ni-IMAC 化学试剂可以耐受较高浓度的还原剂和螯合剂（如 EDTA），而不会降低性能。兼容EDTA的 Ni-IMAC 化学试剂有磁珠（货号 A50588）和树脂（货号 A50585）两种形式。它们特别适合纯化分泌到细胞培养基中的表达型 His 标签蛋白，或纯化需要 EDTA 存在以保持稳定性和功能的细胞内 His 标签蛋白。

通过使用高浓度咪唑（至少 200 mM），低 pH 值（如 0.1 M 甘氨酸-HCl，pH 值 2.5）或过量强螯合剂（如 EDTA），实现从 IMAC 色谱柱中洗脱和回收已捕获的 His 标签蛋白。咪唑是最常见的洗脱剂。

请注意，已知免疫球蛋白的 Fc 区域含有多个组氨酸，并可与 IMAC 支持物结合。如果结合条件不够严格（如使用咪唑），并且免疫球蛋白相对于目标 His 标签蛋白含量较高，则可能产生高背景和假阳性。白蛋白 [如牛血清白蛋白 (BSA)] 也有多个组氨酸，在样品中没有 His 标签蛋白或在结合/洗涤缓冲液中没有咪唑的情况下也能与 IMAC 支持物结合。

Thermo Scientific HisPur 钴树脂是一种带二价钴 (Co 2+ ) 的四价螯合琼脂糖树脂。该树脂的纯度很高，每毫升树脂可回收超过 10 mg 的纯 His 标签蛋白，且无金属污染，也无需优化咪唑洗涤条件。

His 标签蛋白的亲和纯化。用 B-PER 细菌蛋白提取试剂（货号 78243）和蛋白酶抑制剂制备含有过表达重组 6x His 标签的绿色荧光蛋白 (GFP) 的细胞裂解液（货号 78243）和蛋白酶抑制剂。蛋白浓度通过考马斯 Plus 蛋白分析（货号 23238）测定蛋白浓度。将细菌裂解物 (1.0 mg 总蛋白)加入 0.2 mL 柱床体积的 HisPur 钴树脂离心柱上。使用含 10 mM 咪唑的 0.4 mL 洗涤缓冲液洗涤树脂三次。使用含 150 mM 咪唑的 0.2 mL 洗脱缓冲液洗脱 His 标记蛋白三次。凝胶泳道均经过归一化处理为等体积。使用 Imperial 蛋白质染色剂（货号 24615）对凝胶进行染色。M = 分子量标记物， L =裂解物上样量，FT = 流出液。

了解更多应用资料：用于 His 标签融合蛋白纯化的 IMAC 树脂和试剂盒选择产品His 标签融合蛋白纯化选择指南蛋白质制备手册本手册共 32 页，提供了有关我们用于蛋白质提取、净化、免疫沉淀和纯化的各种试剂和工具组合的有用信息。手册中包含操作指南、选择指南和相关数据，可帮助您提高蛋白产量和优化下游分析。

涵盖的具体主题包括以下方面：

细胞裂解和组分分离蛋白质透析和其他纯化技术免疫沉淀和沉降实验其他蛋白制备方法下载《蛋白制备手册》镍，钴和铜

镍是用于纯化 His 标签蛋白的最广泛的金属离子。镍与 His 标签蛋白的结合效率很高，但也容易与含有组氨酸簇的内源性蛋白发生非特异性结合。如上所述，在结合/洗涤缓冲液中加入少量咪唑有助于控制非靶标结合。

钴与组氨酸标签的相互作用更具特异性，从而减少了非特异性作用。因此，当高纯度是首要考虑因素时，钴是纯化 His 标签蛋白的首选二价阳离子。Thermo Fisher Scientific 提供镍和钴 IMAC 树脂两种规格。参阅以下内容。

Ni-NTA 和钴树脂分别可最大限度地提高得率和纯度。凝胶板：将含有过表达 6xHis-AIF2（6 mg 总蛋白）或 6xHis-GFP（4 mg 总蛋白）的细菌裂解物加入 HisPur Ni-NTA 树脂 (0.2 mL) 中，并通过批量结合方法纯化。将相同量的总蛋白应加入 Ni-IDA 和 HisPur 钴树脂中，并根据生产商的说明进行纯化。所有的凝胶泳道均经过归一化处理为等体积。 M=分子量标记物，L=裂解液上样量，FT=流出液。

与钴和镍相比，铜离子与 His 标签蛋白的结合力更强。其结合能力可能最高，但特异性也最差。因此，铜 IMAC 通常只用于不以纯化为目的的结合应用（例如，对已纯化的 His 标签蛋白进行平板包被以用于检测)。

了解更多应用资料：HisPur 钴 Superflow 琼脂糖的性能表征应用资料：HisPur Ni-NTA Superflow 琼脂糖的性能表征选择产品重组蛋白质纯化HisPur 钴树脂HisPur 钴 Superflow 琼脂糖凝胶HisPur 镍-NTA 树脂HisPur 镍-NTA Superflow 琼脂糖凝胶Dynabeads His 标签分离和下拉选择指南

其他 His 标签融合蛋白技术

除了亲和纯化，His 标签融合蛋白的其他应用还可以借助 IMAC 型化学试剂或His标记特异性抗体来实现：

微孔板包被—镍或铜微孔板可从粗样品或半纯化样品中包被融合蛋白，以用于酶标板和各种报告基因测定 ELISA 或蛋白质免疫印迹检测—镍螯合辣根过氧化物酶 (Thermo Scientific HisProbe HRP) 可在不使用抗体的情况下对 His 标签蛋白进行基于 HRP 的检测。此外，还可使用抗 6xHis 抗体。蛋白相互作用沉降— 镍琼脂糖树脂可用于纯化、鉴定和测量 His 标签蛋白的相互作用体凝胶染色—基于金属的荧光染色，可在 SDS-PAGE 中检测 His 标签蛋白质从细胞培养上清液中纯化蛋白时，Pierce 高能力 Ni-IMAC 磁珠（兼容 EDTA）的性能优于供应商 C 的磁珠。含有过度表达 His 标记的 EPO（40 mg 总蛋白）的细胞培养上清液 (Expi293) 应用于“Pierce 高能力 Ni-IMAC 磁珠（兼容 EDTA）”以及竞争对手 C 的微珠。使用制造商推荐的方案和缓冲液处理这些微珠。所有的样本都进行了30分钟的结合。将微珠收集在磁力架上，保存流过物（未结合）组分以供分析。然后洗涤微珠两次，在洗脱缓冲液中孵育15分钟来洗脱结合的蛋白。在 SDS-PAGE 凝胶上分离洗脱液并使用 GelCode 蓝（货号24594）染色。凝胶泳道按体积归一化处理。 M = 分子量标记物、L = 裂解液上样、FT = 流过物、W = 洗涤、E= 洗脱。

*HC = 高能力

在 Expi293 细胞培养基中表达的高效、高纯度地获得表达的His 标签蛋白。将含有过表达 His 标签 HSA（50 mg 总蛋白）的细胞培养上清液加入 Pierce High-Capacity Ni-IMAC 树脂 [与 EDTA 兼容(1 mL 柱）]中并通过 FPLC 纯化。以 0.5 mL/min 流速上样样品，然后洗涤柱，使用含 20 mM 咪唑的洗涤缓冲液冲洗柱，直至基线。使用含 500 mM 咪唑的缓冲液洗脱结合蛋白。在 SDS-PAGE 凝胶上分离洗脱液并使用 GelCode 蓝（货号24594）染色。M = 分子量标记物，L = 裂解液上样量，FT = 流过物，W = 洗涤，E = 洗脱。

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